中药有效成分的分离筛选鉴定一体化技术与分子烙印技术

3.4  应用范围广利用MIPs的选择性，用其作为吸附剂可以实现对目标化合物的提取、纯化和浓缩，使之达到能够被直接检出的浓度，从而降低检测限，提高分析的准确性和精密度，克服样品体系复杂、预处理繁琐等不利因素，为痕量组分的富集和分析提供极大的方便。随着研究的深入，MIT与色谱、毛细管电泳、荧光、电分析法等分析、分离手段结合，利用MIPs的选择性以及多孔性，在药物分析、有害成份检定、环境监测以及催化方面得到广泛应用。

　　3.5  药物研发应用前景大MIP与高效液相和色谱联用技术可以在中药研究开发的如下四大领域应用［2］：

　　3.5.1  寻找先导化合物以一种已知的活性化合物为模板合成相应的分子烙印聚合物，可以将其用于合成的组合化学库或者天然组合化学库-中药体系(包括复方)，直接从构型多样的库中提取出来其他结构类似的先导化合物，从而避免了传统分离提取的非特异性和低效性。

　　3.5.2  寻找已知药物替代品高活性的抑制剂在成为药物之前，必须经过药理研究、毒性筛选等，许多有效的抑制剂往往因为高毒性或副作用，或者在体内吸收不好而无法最终成药。而中药的毒性较小。若以某种高效高毒性的分子作为模板分子烙印出来的聚合物，可以直接从这种天然组合化学库中筛选出来其他有效并且低毒性的化合物作为替代品；或者某种高效无毒的药物分子由于合成困难而导致非常昂贵，此时也可以用分子烙印的方法寻找其他成本低廉且容易得到的替代品。

　　3.5.3  高效提取微量(或痕量)成分在中药的传统分离提取过程中，许多有效成分往往因为含量低微而被漏筛或者难以纯化出来，利用分子烙印的强特异性和高选择性可以将一些含量很低的化合物直接从粗提物中提取出来。

　　3.5.4  制定中药质量标准中药在中国的应用已经有几千年的历史，但往往由于其成分的复杂性和有效成分不够明确而难以在国际市场上被认可。如果能够利用分子烙印的方法对某些有效成分的含量进行监控(可以用色谱或者质谱的手段检测目标产物的存在及确定其含量)，制定一套质量标准，将有利于中药的进一步应用推广。

　　4  MIT在中草药有效成分分离鉴定中的应用研究
   
　　MIP分离化合物的机制见图3所示［12］。MIP 应用于动物组织中药物及其代谢物、中草药成分提取分离的研究报告较多，也取得了一批有价值的分析方法和材料［13］。如郭文生等［14］采用分子模板聚合物技术对中草药马钱子Strychnos nux-vomica L. 粗提物中有效成分马钱子碱(brucine)、士的宁(strychnine) 进行了选择性分离。用丙烯酸为单体，TMPTA为交联剂，合成对马钱子碱有特异选择性的模板聚合物(MIP)。选择性分离出粗提物中的马钱子碱，纯度可达99.7 %，同时得到士的宁为主的生物碱，纯度为94.6 %。周力等［15］制备了以槲皮素为模板的分子烙印聚合物（ABC），从沙棘粗提物中分离提取槲皮素和异鼠李素两种黄酮，得到良好的效果。

　　a-表示MIP的连接位置对烙印分子有较高的装载能力；b-表示由于烙印分子对MIP有较高的亲和力使得烙印药物分子缓慢释放；c-表示烙印对应体（+）被吸附在MIP上，而非烙印对应体（-）由于对MIP连接位置的不相配而释放；d-表示在连接位置，由于亲和力的作用，有较低亲和力的药物被有较高亲和力的药物所取代。

　　图3  类似药物在分子烙印材料上的装载释放过程（略） 
   
　　MIP-HPLC-MS应用于中草药有效成分分离鉴定研究报告较少，但以仅有的报告来看，其前景看好。谢建春等［16］以骆驼蓬种籽中抗肿瘤活性化合物哈尔明及哈马灵的结构类似物哈尔满作为模板，用非共价键法制备了对哈尔明及哈马灵具有强亲和性的分子烙印聚合物。此分子烙印聚合物作为液相色谱固定相与大气压电离飞行时间质谱联用，直接分离鉴定了草药骆驼蓬种籽甲醇粗提物中所含的哈尔明及哈马灵两种抗肿瘤活性成分。实验结果证明了通过分子烙印亲和色谱与质谱联用方法，快速有效地对中草药活性成分分离鉴定是可能的。谢建春等［17］尝试以丙烯酰胺作为功能单体，以槲皮素为模板，在极性溶剂中，用非共价键法制备了MIP。结果表明，MIP对槲皮素具有特异亲和性，将该MIP直接分离银杏叶提取物水溶液，得到主要含模板槲皮素及其结构类似化合物山奈酚两种黄酮类组分。利用MIP特异亲和性从中药复方中提取、分离具有相同空间结构、相似功能团的有效部位，将会成为中药复方有效部位提取、分离的有效手段。Vallano等［18,19］利用分子烙印的原理，以抗抑郁症的去甲替林(NOR)为模板，将去甲替林烙印粒子填充在毛细管HPLC柱上，利用毛细管液相色谱筛选结构类似的抗抑郁症化合物，结果表明具有和模板大部分结构类似的化合物都能被印迹分子所识别, 尤其是具有环和亚胺的化合物选择性更好。

　　5  MIT的发展趋势
   
　　分子烙印高分子技术与分离鉴定的一体化技术，其核心是基于MIPs的快速高效发展。在未来一段时间MIT的研究可能主要集中在如下几个方面：①分子烙印和识别过程的机理，从热力学和动力学角度研究增多，从目前的定性和半定量描述向完全定量描述发展，其应用范围进一步扩大；②合成种类更多、性能更好的功能单体和交联剂，提高MIPs的吸附行为和吸附容量，如最近虽已提出聚酚、聚氨苯基硼酸酯、过度氧化的聚吡咯、聚氨酯、聚苯二胺、聚苯胺等，但仅能适应相应特殊要求，性能尚待完善；③分子烙印和识别过程从有机相转向水相，以便接近或达到天然分子即模拟机体内识别系统的水平，从而提高分子烙印聚合物的选择性和模拟受体的真实性；④在分离技术方面，手性分离和固相萃取手性药物的MIT步入产业化阶段，而商品化的可用于检测特定化合物的MIPs将不断出现；⑤烙印技术将从氨基酸、药物等小分子，过渡到核苷酸、多肽、蛋白质等生物大分子，甚至生物活体细胞；⑥MIP向高效率高特异性发展，如模板与功能单体间的多位点协同作用可提高MIP选择性，同时最好结合多种作用力。如Cheng等［20］在制备模拟酶时同时采取3种单体(MAA、4-VP和高铁原卟啉)、3种作用力(氢键、静电和金属配位作用) ，实现了水相中高的选择性和催化性能。

【参考文献】
  ［1］ 杜冠华. 药物筛选新技术与中药现代化研究［J］. 世界科学技术-中药现代化，2000，2（24）：47.

　　［2］ 王 夔. 中药研究现代方法学［M］. 北京：化学工业出版社， 2004∶42.

　　［3］ 赵惠茹，杨广德，贺浪冲. 用细胞膜色谱法筛选当归中的有效成分［J］. 中国药学杂志，2000，35（1）∶13.

　　［4］ 张汉利，杨广德，贺浪冲. 太白花活性成分的筛选与药理作用相关性研究［J］. 中国药学杂志，2003，38（2）：∶92.

　　［5］ 高 琨，贺浪冲，杨广德. 用细胞膜色谱法筛选研究红毛七中的有效成分［J］. 中国药学杂志，2003，38（1）∶14.

　　［6］ 谢建春，骆宏鹏，朱丽莉，等. 利用分子烙印技术分离中草药活性组分［J］. 物理化学学报，2001，17 (7) ∶582.

　　［7］ C.J. Allender, C. Richardson, B. Woodhouse, et al. Pharmaceutical applications for molecularly imprinted polymers［J］. International Journal of Pharmaceutics, 2000, 195: 39.

　　［8］ Giancarlo Masci, Giulia Casati, Vittorio Crescenzi．Synthesis and LC characterization of clenbuterol molecularly imprinted polymers［J］. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 2001, 25(2): 211.

　　［9］ Michael J. Whitcombe, M. Esther Rodriguez, Pablo Villar, et al．A new method for the introduction of recognition site functionality into polymers prepared by molecular imprinting: synthesis and characterization of polymeric receptors for cholesterol［J］. Journal of American Chemical Society, 1995, 117(27): 7105.

　　［10］ Jorge Luis Suárez-Rodríguez, Marta Elena Díaz-García．Fluorescent competitive flow-through assay for chloramphenicol using molecularly imprinted polymers［J］. Biosensors & Bioelectronics, 2001, 16(9-12): 955.

　　［11］ WANG Jin-Fang, ZHOU Liang-Mo, LIU Xue-Liang, et al．Novel polymer system for molecular imprinting polymer against amino acid derivatives［J］. Chinese Journal of Chemistry, 2000, 18(4): 621.

　　［12］ Cornelus F. van Nostrum. Molecular imprinting: A new tool for drug innovation［J］. Drug Discovery Today: Technologies. 2005, 2（1）:119.

　　［13］ 林 喆, 罗 艳, 原 忠.分子印迹技术在中药活性成分分离纯化中的应用［J］. 中草药，2007,38（3）: 457.

　　［14］ 郭文生,丁 超，宛彤昕，等. 从马钱子中选择分离马钱子碱新方法的研究［J］. 天然产物研究与开发, 2002, 16（2）：97.

　　［15］ 周 力，谢建春，戈育芳，等.分子烙印技术在沙棘功效成分提取中的应用［J］. 物理化学学报，2002，18（9）：808.

　　［16］ 谢建春，朱丽荔，徐筱杰. 分子烙印亲和色谱与质谱联用实现中草药活性成分分离鉴定一体化［J］. 化学学报，2002，60（3）：385.

　　［17］ 谢建春，骆宏鹏，朱丽莉，等. 利用分子烙印技术分离中草药活性组分［J］. 物理化学学报，2001，17 (7) ∶582.

　　［18］ Vallano P T, Remcho V T. Affinity screening by packed capillary high-performance liquid chromatography using molecular imprinted sorbentsⅠDemonstration of feasibility［J］. J.Chromatogr. A, 2000, 888:23.

　　［19］ Khasawneh M A, Vallano P T, Remcho V T. Affinity screening by packed capillary high performance liquid chromatography using molecular imprinted sorbentsⅡCovalent imprinted polymers［J］. J.Chromatogr.A, 2001, 922:87.

　　［20］ Cheng Z Y, Zhang L W, Li Y Z. Synthesis of an enzyme-like imprinted polymer with the substrate as the template, and its catalytic properties under aqueous conditions［J］. Chem. Eur. J ., 2004, 10 :3555.