中药有效成分的分离筛选鉴定一体化技术与分子烙印技术

【摘要】  应用现代科学技术研究中药有效成分，是中药现代化研究的重要内容。利用分子烙印高分子制成亲和色谱柱，利用色谱分离技术的高速高效性和质谱测定技术的高灵敏度和独有的混合解析能力，在线连接HPLC-MS，可以直接从中药复杂体系中分离、筛选出有效成分并进行直接鉴定，实现中药有效成分的分离、筛选、鉴定一体化技术。文章简要从分子烙印聚合物及其制备、模板分子、功能性单体及聚合条件的选择、技术特点、应用状况及前景等方面简单介绍中草药有效成分筛选鉴定一体化技术中最有应用前途的分子烙印高分子技术。

【关键词】  中药有效成分； 分离筛选鉴定一体化技术； 分子烙印技术

　　Abstract：It is an important aspect of modernization for Chinese traditional herb that active composition of Chinese traditional herb is studied with modern science and technology.Affinity chromatography is prepared through molecularly imprinted polymers (MIPs) . Based on high performance of chromatographic separation technology and highly sensitive and special combinational analysis ability of mass spectrogram, MIP-HPLC-MS is connected. Therefore, active composition from Chinese traditional herb may be separated, selected and identified, which realized combinational technology of separation, selection and identification for active composition of Chinese traditional herb. The mechanism of molecular imprinting technology (MIT) and synthetic processes of MIPs were introduced in this paper. Application of MIT for separation, selection and identification for active composition of Chinese traditional herb were summarized, and the trends of MIT were also discussed in this paper.

　　Key words： Active composition of Chinese tradational herb；  Combinational technology of separation,selection and identification；  Molecular imprinting technology
   
　　随着科学技术的快速发展，现代药物的创制经历了由快速、低成本向研发周期延长、高成本的模式发展。为了加速新药研制的速度，欧美制药公司不断地采用及开发先进技术。例如，采用组合化学方法快速生产建立包含成千上万化合物的库；采用各种快速高效的筛选检测方法去发现药物前体；将药物新陈代谢机理和毒性的研究提前到药物发现这一环节来进行等。中药是我国的优秀特色医药遗产，其种类繁多，历史悠久，实践证明对许多疾病疗效确实。因此，从中草药中创制新型药物是切实可行又简捷的方法。
   
　　应用现代科学技术研究中药有效成分，是中药现代化研究的重要内容。经过几十年的努力，已经取得了许多重要成果，发现了大量活性化合物，有些已经开发成新型的药物。事实证明，中药有效成分是中药发挥治疗作用的物质基础。但到目前为止，仅有一百多种常用中药的主要成分经过了比较详细的研究，大量中药及其成分仍有待研究。研究中药含有的有效成分，特别是对大量的中药进行活性成分的研究，应用高通量药物筛选的方法具有明显的优势，可以提高研究速度和效率。高通量药物筛选需要大量的样品，也可以借助新的样品制备方法和设备，提取不同的样品，包括单一化合物、提取组分或部位。同时积累各种中药样品，建立样品库，供不同的筛选模型使用，提高样品的利用率。对中药单一化合物成分的活性筛选，可以根据获得的结果直接评价化合物的生物活性和药理作用。但对于含有多种成分的提取物或部位，则可以根据活性结果进行跟踪提取分离，最终发现活性化合物或确定活性组分［1］。
   
　　将化合物分离鉴定手段与高通量药物筛选技术相结合，可以直接对提取的组分进行分离和活性检测并鉴定，不仅可以节省研究费用，提高发现活性化合物的速度，同时也可以保证研究目标的准确性。
   
　　基于分子识别原理，根据靶酶、分子烙印高分子及药物抗体与活性成分结合能力的差异，分别利用靶酶、分子烙印高分子及药物抗体制成亲和色谱柱，利用色谱分离技术的高速高效性和质谱测定技术的高灵敏度和独有的混合解析能力，在线连接HPLC-MS，可以直接从中药复杂体系中分离、筛选出有效成分并进行直接鉴定，实现中药有效成分的分离、筛选、鉴定一体化技术，其过程如图1所示。这是最近几年出现的药物筛选新技术之一［2］。如利用细胞膜色谱法筛选鉴定了当归、太白花、红毛七中的有效成分［3～5］；利用抗体亲和色谱柱筛选出抗丙型肝炎的先导化合物；利用分子烙印聚合物亲和色谱柱成功筛选出抗肿瘤的EGFR抑制剂，实验证明活性化合物在这几种柱中的保留时间与活性成正比［6］。

　　图1  中药有效成分的分离、筛选、鉴定一体化技术（略） 
   
　　由于MIPs具有较高的预定选择性，独特的化学、物理稳定性，分子识别能力不受酸、碱、热、有机溶剂等环境因素影响的优点，以及制备简单、可重复使用等特点，在分离、分析中展示了美好的应用前景。下面从分子烙印聚合物及其制备、模板分子、功能性单体及聚合条件的选择、技术特点、应用状况及前景等方面简单介绍中草药有效成分筛选鉴定一体化技术中最有应用前途的分子烙印高分子技术。

　　1  分子烙印聚合物及其制备
   
　　分子烙印技术，也称分子印迹技术（MIT），其应用前提是能够制备出具有分子识别能力的聚合物材料-分子烙印聚合物(MIPs)。MIPs的制备过程大致为：①将模板分子和功能单体按照一定比例混合后在一定条件下反应，通过共价键或非共价键作用形成可逆的模板分子-功能单体复合物；②加入交联剂等，使之与前面的模板-功能单体复合物通过聚合反应形成多孔性的高聚物；③将模板分子从高聚物中抽提出来，这样在聚合物的骨架上便留下了一个对模板分子有“预定”选择性的分子识别位。分子烙印聚合物中的空腔和模板分子形状、大小完全一样，从而实现对模板分子的特异性识别。其过程见图2 ［7］。
    
　　根据模板分子和功能单体形成复合物时作用力的性质，MIPs分为共价型和非共价型两种。共价型MIPs制备过程中，模板分子和功能单体通过可逆的共价作用，如形成可逆的硼酸酯和席夫碱。而在非共价型MIPs生成过程中，模板分子和单体则可通过氢键、偶极、离子、金属螯合、电荷转移、π-π共轭作用、疏水乃至范德华力等相互作用形成复合物。

　　图2  分子烙印材料的制备过程示意图（略） 
   
　　当这些微弱的相互作用在溶液中建立起来后，参与自组装的分子自发地安置在液相溶剂中，聚合作用被引发，这些分子因高度的交联聚合作用而在空间上被固定，然后将模板分子抽提移走，中间形成一个空穴。用这种方法合成的MIPs检验模板分子和/或类似物时，其扩散进入分子烙印聚合物的互补位置，它们之间又能重新成键。
   
　　共价型MIPs中，单体-模板所形成的配合物十分稳定，且相互间存在着当量关系。因此分子烙印过程（即高聚物内客体键合点的结构等）明确而清晰；由于共价连接的稳定性，因此可在较宽的聚合条件下，如在高温，高或低的pH，或高极性溶剂中进行聚合。但是，单体-模板配合物的合成较困难，同时也不经济；可以采用的可逆共价联接体系数目有限；在某些情况下，会因第3步剧烈的工作条件（使共价键联接断裂）而使烙印效果变差；客体的结合和释放都较慢，这是因为它们都涉及键的形成和断裂过程。
   
　　非共价键型MIPs中，不必合成共价的单体-模板配合物；因为其之间仅有较弱的非共价相互作用力，可在温和的条件下将模板从聚合物中除去，同时客体的键合和释出都有很快的速度。但是，烙印过程的轮廓不够清晰，因为单体-模板加成物易于变化，而无严格的计量关系；聚合过程的条件必须仔细加以选择，使混合物中非共价的加合物能最大程度的稳定存在；由于在大量功能单体存在的条件下（为使平衡有利于加合物生成）常会出现非特征的键合点，于是体系结合底物的选择能力降低。对非共价键克仑特罗MIPs的液相色谱特性的研究表明，在磷酸盐缓冲液/乙腈洗提条件下，其可以识别出其他所有肾上腺素结构样物质［8］。目前绝大多数MIPs均是通过非共价型MIT制得的。
   
　　除了以上两种基本模式以外，还有一种将这两种模式综合在一起的技术，即聚合时功能性单体与模板分子间的作用力是共价键，而在对烙印分子的识别过程中，二者之间的作用力是非共价键。Whitecombe等［9］将胆固醇与功能性单体4-乙烯基苯基碳酸酯共价结合后，用碱水解时随着CO2的释去而打开了单体和烙印分子间的共价键，此时MIP上便产生了一个非共价型的分子识别位，在分子识别中通过氢键结合胆固醇。用这种方法已经制备了体积较大底物（如药物分子、类固醇、糖类等）的分子烙印聚合物，这些聚合物具有多位结合的结构。

　　2  模板分子、功能性单体及聚合条件的选择
   
　　MIPs形成中经过的两大步骤是两个相反的过程，它要求模板分子既能参加聚合反应，又能提取出来。作为模板的分子都应含有形成弱相互作用力或可逆共价键的基团，能满足要求的化合物主要有糖类（包括甘露糖、半乳糖、果糖）、氨基酸及其衍生物；蛋白质、核苷酸及其衍生物；嘌呤、嘧啶等生物碱；羧酸、二醛、胆固醇、维生素、酶、神经递质如乙酰胆碱；杀虫剂、除草剂、染料、药物以及重金属等。
   
　　功能单体的选择主要由模板分子决定，首先必须能与模板分子成键，且在反应中它与交联剂分子处于合适的位置，能使模板分子恰好镶嵌其中。常用的功能性聚合单体有甲基丙烯酸（MAA）、4-乙烯苯基硼酸、吡啶衍生物、丙烯酰胺等等。一般认为MAA与氨基之间可发生质子化作用，同酰基、羧基、氨基甲酸酯之间可产生氢键作用。为得到稳定的模板-单体复合物，所选择的功能单体应与模板间存在尽可能强的分子间作用力（如氢键、离子对作用等），因此对含有碱性官能团（如氨基等）的模板应选择含羧基的功能单体（MAA等）；而含酸性功能基团（如羧基、酚羟基）的模板应尽可能用碱性功能单体如乙烯基吡啶。有时根据模板分子的结构，采用与模板分子具有多作用位点的功能单体，可使聚合物的选择性大大提高。此外，对某些模板分子采用混合功能单体，亦能提高分子烙印聚合物的选择性。Jorge Luis［10］在研究氯霉素分子烙印时采用混合功能单体，二乙氨基乙基丙烯酸甲酯（DAM）与2-乙烯基吡啶摩尔比是25 : 75，混合功能单体与氯霉素的摩尔比为2 : 1，在50 ℃条件下，制备的氯霉素分子烙印聚合物，实验结果表明混合功能单体聚合物的烙印效果优于单一功能单体；Wang等［11］在研究氨基酸衍生物分子烙印时，2-乙烯吡啶和丙烯酰胺的混合物为功能单体，也得到了类似的结果。
   
　　交联剂最常见的主要是乙二醇二甲基丙烯酸酯（EDMA）、季戊四醇三丙烯酸酯以及一些乙烯基衍生物，如二乙烯基苯等。
   
　　分子烙印过程主要通过自由基引发，其引发方式主要有高温热引发和低温光引发。具体的聚合条件选择则视具体情况而定，因为影响反应的因素很多，如浓度、温度、光照及溶剂的种类和极性等。常用的引发剂有偶氮二异丁腈（AIBN）、偶氮二异庚腈（ADVN）等。
   
　　由于非共价作用的强弱强烈地依赖于溶液的极性，所以非共价方式一般选择在有机溶液如氯仿、甲苯中进行，而共价方式一般选择在极性较强的水、醇等溶液中进行。

　　3  分子烙印技术(MIT)的特点

　　3.1  选择性高MIP依靠分子形状、大小及官能团进行分子识别，类似于生物体系中酶对底物、抗体对抗原或受体对抑制剂的作用，因此，其对模板化合物及其类似物（包括空间结构相似的化合物）具有较高的选择性，在某些体系中，MIP的识别已优于传统方法制备的抗体，从而MIP又被称为模拟抗体。目前，MIP作为分子识别材料，除了被用于手性分离、免疫分析、传感器、模拟酶催化以外，在固相萃取(SPE)方面的应用也越来越引起人们的注意。

　　3.2  稳定性好与生物大分子（酶或抗体）相比，MIP具有制备简单、周期短、性质比较稳定（耐酸、碱，耐高温、高压等）、可在普通条件下存放、能重复多次使用的优点。

　　3.3  药物筛选模型的替代性对有些疾病尚无筛选模型或所建立的药物筛选模型繁琐危险性较高，可以以对该疾病防治确实的已知药物为模板，研制MIP与高效液相和色谱联用技术作为高通量预筛模型的最佳替代，前景广阔。