神经营养因子家族及其受体在重组人骨形态发生蛋白

    1  材料和方法
    11  动物和材料
    雄性ICR小鼠36只，体重20~22 g。实验使用的rhBMP2胶原复合诱导材料（骨诱导，含rhBMP 2025mg／片）和胶原海绵均由华东基因技术研究所提供。NTFs及TrkA、TrkB、TrkC兔抗小鼠多克隆抗体及SABC免疫组化试剂盒购自武汉博士德公司，RTPCR试剂盒购自宝生物工程（大连）有限公司。
    12  动物实验模型
    将36只ICR小鼠随机分为实验组和对照组，每组18只。******腹腔注射麻醉，取rhBMP2复合材料1／2片（含0125 mg rhBMP2）植入实验组小鼠右侧股后部肌间隙中，对照组小鼠植入相同大小胶原海绵。两组分别于术后第7、14和21 d各处死6只小鼠取材，分别进行组织学、免疫组织化学检测和NTFs mRNA的RTPCR检测。
    13  检测项目
    131  组织学观察
    标本采用4％多聚甲醛固定24 h，第14及21 d所诱导骨组织需采用10％EDTA脱钙液脱钙，充分水洗，逐级脱水、浸蜡，常规石蜡包埋，3μm连续切片，行HE染色，光镜下观察。
    132  免疫组化染色（SABC法）
    石蜡切片经脱蜡入水后，3％H2O2+甲醇灭活内源性过氧化氢酶，正常羊血清封闭，采用SABC法进行免疫组化染色。抗原经微波热修复后，分别滴加NGF、BDNF、NT3和TrkA、TrkB、TrkC兔抗小鼠多克隆抗体（工作液浓度为1∶200），室温下孵育2 h。生物素化山羊抗兔IgG及SABC复合物各孵育30 min，各步骤间均采用001 mol/L PBS洗涤。以二甲基联苯胺（DAB）显色，阳性显示为棕色，苏木素轻度复染。
   133  RTPCR法检测NTFs mRNA的表达
    采用Qiagen RNA试剂盒抽提实验组样本总RNA，采用Takara一步法RTPCR试剂盒扩增小鼠NGF、BDNF、NT3及内参照G3PDH的cDNA。经15％琼脂糖凝胶电泳后，采用凝胶图像系统进行图像采集和分析。根据小鼠上述cDNA序列设计引物：NGF上游引物：5′ATAAAGGTTTTGCCAAGGACG3′，下游引物：5′GGGGTCTACAGTGATGTTGCG3′，扩增产物长度为281 bp。BDNF上游引物：5′GCCCAACGAAGAAAACCATAA3′，下游引物:5′TCGGCATTGCGAGTTCCAGT3′，扩增产物长度为394 bp。NT3上游引物：5′AGTGACAGCACCCCTTTGGAG3′，下游引物：5′CGGACATAGGTTTGCGAAGTT3′，扩增产物长度为359 bp。以G3PDH作为内参照，其上游引物：5′AAGGCTGTGGGCAAGG3′，下游引物：5′GGAGATTCAGTGTGGTGGG3′，扩增产物长度为469 bp。将NGF、BDNF、NT3与内参照G3PDH的cDNA条带的吸光度对比，进行不同时间段的比较。
    2  结  果
    21  组织学观察
    HE染色结果显示：实验组术后第7 d，大量软骨前体细胞、软骨细胞和肥大软骨细胞周围形成，伴有毛细血管和间充质细胞侵入软骨组织中，并可见由此分化而来的成骨细胞。第14 d，大量的骨样组织和编织骨形成小梁状骨结构，可见原始骨髓腔、骨髓细胞，成骨细胞排列于骨组织表面，残留的软骨细胞转变为骨样细胞。第21 d，小梁骨进一步成熟，可见有编织骨塑形为板层骨，骨陷窝清晰可见，骨髓腔内有大量骨髓细胞和脂肪滴（图1）。对照组各时间段均未见有骨组织形成。
    22  免疫组化染色
    NGF和TrkA免疫组化结果显示：实验组术后第7 d，成软骨细胞、软骨细胞、肥大软骨细胞、成骨细胞以及周围的成纤维细胞中均有广泛的阳性染色，在部分软骨细胞外基质中也可见阳性染色。第14 d，在新生骨组织表面部分成骨细胞、成骨样细胞和幼稚骨样细胞中有阳性染色，同时破骨细胞以及骨髓组织中的巨噬细胞和多核巨细胞亦呈现阳性染色。第21 d，阳性细胞进一步减少，仅在少数骨表面成骨样细胞和破骨细胞中有阳性染色，骨髓中巨噬细胞和多核巨细胞阳性表达亦减少。TrkA和NGF的表达基本相似（图2）。
    BDNF和TrkB免疫组化结果显示：实验组术后第7 d，在软骨细胞以及软骨基质中有明显的表达，尤其在软骨基质中表达最为显著；术后第14、21 d均未见明显阳性染色。TrkB仅于术后第7 d于软骨细胞和成软骨细胞中有阳性表达，而术后14、21 d未见表达（图3）。
    NT3和TrkC免疫组化结果显示：实验组术后第7 d，于成软骨细胞、软骨细胞、肥大软骨细胞以及成骨细胞中均见明显的阳性染色；术后14 d，于软骨细胞和成骨细胞中可见表达，术后21 d未见表达。TrkC仅于术后第7 d于成软骨细胞和软骨细胞中有表达，而术后14、21 d均未见表达（图4）。
    23  NGF、BDNF、NT-3及G3PDH mRNA的检测结果
    RTPCR结果显示：实验组于术后第7 d，NGF、BDNF及NT3 mRNA均有明显的表达。第14 d NGF及NT3 mRNA表达均有所减弱，而BDNF未见明显表达。第21 d NGF mRNA可见弱表达，而BDNF和NT3 mRNA无明显表达（图5）。
    3  讨  论
    BMP被发现以来，人们已认识到这种唯一具有异位诱导成骨能力的骨生长因子在骨折愈合过程中起着关键作用。大量实验和临床研究已证实天然和重组人BMP具有显著的诱导成骨、促进骨修复的作用。本研究组织学发现，rhBMP2胶原复合材料具有良好的异位诱导成骨能力，植入后第7 d即有大量软骨前体细胞、软骨细胞、成骨细胞和类骨组织的形成，周围有大量成纤维细胞增殖聚集，第14 d可见小梁状骨以及骨髓腔、骨髓组织的出现，第21 d板层骨以及成熟骨髓组织形成。而对照组未见任何成骨现象。